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“这个实验其实不不难,一共只分为两步。”
“首先是聚合酶链式反应,即PCR扩增反应;第二步是酶切反应。”
张兴运介绍道。
第一步,在PCR扩增反应部分,只需要跟着想要的结果,明确各种试剂和样品的加入量以及扩增条件,按照正常的要求操作即可。
需要注意的是,吸取试剂时,一定要排尽气泡,由于试剂的加入量都非常小,滴加试剂时,常常出现试剂聚集在枪头尖端,形成一个小液滴,难以滴下,可以将液滴打到离心管内壁上。
利用其与离心管内壁的吸附作用力,将液滴留在离心管内。
最后,再用无菌超纯水补足3滴反应体系后,将离心管盖盖好,至于离一t2机中,离心30秒,以使试剂、样品和水在离心管底部充分混匀。
更有利于PCR反应的顺利进行,可以大大增加扩增反应的成功率。
至于酶切反应。
可以在滴加实验一得到的结果后,再滴加适量BSA,它是一种酶切反应催化剂,能够使酶切反应进行更彻底。
酶切效果更好:通常试剂一与BSA的体积比约为1:2。
“我们在在川贝母的PCR鉴别试验中,SmaI加入量为0。5斗l,BSA的加入量为1斗。滴加BSA后,酶切反应的体系仍为20斗,所以无菌超纯水的加入量要相应减少。酶切反应的条件应设置为30,反应2h。”张兴运说道。
陈浩然还是沉默。
但这种沉默已经代表了一种态度。
不赞同,不拒绝。就静静的看着,即便你作死也好,即便你成仙也罢,他都这么静静的看着。
当然,实验室里面的实验还在继续。
“电泳检测酶切反应完成后所得到的溶液。得到的结果是?”杨光问道。
“含有标准规定的长度在100~250bp的两条DNA条带,需要用琼脂糖凝胶电泳法进行检视。”终于回答道。
走到这一步,实验的还在继续。
但至少杨光并没有再提出什么质疑。
钟医和杨光还是按照实验步骤再进行,首先,需要制胶和配制电泳缓冲液,制胶用缓冲液和电泳缓冲液应保持一致,用百分之1的TAE或TBE即可。
“注意,在制胶过程中注意做好防护,切勿烫伤。”钟医提醒道。
“假好心。我会出事?”杨光没气的说道。
两人,待胶溶液温度下降至60℃左右时,滴加少量GelRed,振摇混匀后缓慢倾倒人插好梳子的胶槽中,他们尽量不产生气泡,以免影响电泳效果。
待胶凝固并冷却至室温后。即可将其转移至电泳槽中,准备电泳。
下一步,两人依次将样品、对照药材、空白对照加入胶孑L中。
杨光特别小心,手十分稳,没有戳破胶孑L边缘或戳穿胶孔底部。以免影电泳效果。
“他们现在再加加样缓冲液,这样做主要是两个作用。”
“一方面其密度较大,可使样品沉积在胶孔底部,避免样品上浮外溢,保障电泳条带密集紧凑,防止扩散。”
“另一方面,其中添加染色剂。可以在电泳过程中指示前沿。电泳结束后。可将凝胶置于凝胶成像仪上进行检视。”
张兴运说道。
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